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Etude de l'embryogenèse somatique et transformation génétique de différentes variétés de porte-greffes de vigne en vue d'induire la résistance au Grapevine Fanleaf Virus
Benard-Gellon, Mélanie (1983-....)
Résumé
Dans cette étude, nous avons dans un premier temps adapte le protocole d'embryogenèse somatique primaire a différentes variétés d'hybrides porte-greffes (3309C, 110R, Fercal, 41B et SO4) en nous appuyant sur l'expérience acquise au laboratoire sur Vitis vinifera cv Chardonnay.
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Les résultats montrent que le génotype, le type d'explant (étamine, fleur ou nœud), le type et la dose d'auxine utilisés dans le milieu d’induction (2,4-D ou 2,4,5-T) ont une influence sur les efficacités d'embryogenèse somatique. En effet, pour le 3309C, l'utilisation du 2,4,5-T dans le milieu d'induction a montré une efficacité embryogène supérieure à partir de nœuds par rapport à celle obtenue à partir d'étamines. Cependant la meilleure efficacité a été obtenue à partir de fleurs de cette variété, sur un milieu d'induction contenant du 2,4-D. De plus, le protocole d'embryogenèse somatique secondaire utilise de manière récurrente au laboratoire nous a permis d'obtenir des masses embryogènes ainsi que des embryons somatiques secondaires de ces porte-greffes. Le protocole de conversion des embryons en plantes, en présence de 4,5 uM de cytokinine (BAP) s'est avère efficace pour le 11OR et le 41B. Dans un second temps, nous avons co-cultivé le matériel embryogène obtenu pour quatre de ces génotypes (110R, 3309C, Fercal et 41B), avec Agrobacterium tumefaciens contenant trois constructions génétiques : (i) une copie d'une séquence partielle (1020 pb) du gène de la coque protéique du virus en orientation sens; (ii) une partie courte en sens et en anti-sens (280 pb) de cette même séquence formant une structure en épingle a cheveux (hpRNA = hairpin RNA) ; (iii) un amiRNA ciblant une séquence virale. Le gène bactérien codant la néomycine phosphotransférase et conférant la résistance à un antibiotique, la kanamycine, a été utilisé comme gène de sélection. Les conditions de sélection a la kanamycine ont nécessité des adaptations expérimentales telles que l’ajustement de la concentration en antibiotique puisque la sélection avec 75 mg.L-1 de kanamycine s'avère insuffisamment drastique dans Ia plupart de nos expériences de co-cullture. Les résultats d'analyse moléculaire par PCR ont montré l'amplification probable des fragments d'intérêt (CPGFLV et amiRI1TA-71) dans des échantillons de 11OR et de 41B résistants à la kanamycine. Cependant des analyses moléculaires supplémentaires par AL-PCR ne nous ont pas renseignées sur une éventuelle intégration du transgène amiRATA-71 dans des masses embryogènes de 41B..In this study, we initially adapted the protocol of primary somatic embryogenesis in different varieties of hybrid rootstocks (3309C, 110R, Fercal, 41B and SO4) building on the experience gained in the laboratory on Vitis vinifera cv Chardonnay. The results show that the genotype, the explant type (stamen, flower or node), the type and the dose of auxin used in the induction medium (2,4-D or 2,4,5-T) influence the efficiency of somatic embryogenesis. Indeed, for the 3309C, the use of 2,4,5-T in the induction medium showed a higher efficiency from embryogenic nodes compared to that obtained from stamens. However, the better efficiency was obtained from the flowers of this variety on an induction medium containing 2,4-D. In addition, a protocol used in the laboratory for secondary somatic embryogenesis allowed us to obtain embryogenic masses as well as secondary somatic embryos from these rootstocks. The protocol conversion of embryos into plants, in the presence of 4.5 [tM of cytokinin (BAP), was effective for the 110R and 41B. In a second step, we co-cultivated embryogenic material obtained for four of these genotypes (110R, 3309C, Fercal and 41B), with Agrobacteriwn tumefaciens containing three genetic constructs: (i) a copy of a partial sequence (1020 bp) of the coat protein gene of the virus in the sense orientation, (ii) a short part-way and antisense (280 bp) of the same sequence forming a hairpin structure (hairpin RNA = hpRNA) (iii) one amiRNA targeting a iral sequence. The nptll bacterial gene encoding neomycin phosphotransferase and conferring resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selection gene. The selection conditions to kanamycin have required experimental adaptations such as adjusting the concentration of antibiotic because the selection with 75 mg.L-1 of kanamycin was not enough drastic in most of our experiments of co-culture. The results of molecular analysis by PCR showed probable amplification of fragments of interest (CPGFLV and amiRNA-71) in samples of 11OR and 41B resistant to kanamycin. However, additional molecular analysis by AL-PCR did not inform us about a possible integration of the transgene amiRNA-71 in embryogenic masses of 41B.
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